Influencia de la temperatura de cultivo en la eficiencia de transformación e integración de genes en cepas de Kluyveromyces marxianus autóctonas

Abstract

El presente trabajo tuvo como objetivo estudiar el efecto de la temperatura sobre la estructura de la pared celular y su relación con la eficiencia de transformación genética en cepas autóctonas de Kluyveromyces marxianus. En primer lugar, se determinó la ploidía de cinco cepas mediante PCR y análisis in silico de borradores genómicos, identificando que Kmx 14, Kmx 15, Kmx 22 y Kmx 24 son diploides, mientras que Kmx 16 es haploide de tipo a, lo que facilita su uso en estudios de transformación genética. Posteriormente, se evaluó la influencia de la temperatura sobre el crecimiento y la estructura de la pared celular. Todas las cepas crecieron en medio sólido hasta 45°C, excepto Kmx 11 y Kmx 15, solo lo hicieron hasta 42°C. En cultivo líquido, la mayoría alcanzó su tasa máxima de crecimiento (µmax) a 42°C. Para caracterizar la pared celular, se realizaron ensayos de sensibilidad al blanco calcoflúor (CFW), los cuales sugirieron una mayor proporción de quitina en Kmx 11, Kmx 15 y Kmx 22, y una pared más resistencia en que la exposición a 42°C promueve una mayor resistencia a la lisis celular, indicando un refuerzo estructural de la pared frente al estrés térmico. Con base en estos hallazgos, se estableció un protocolo de transformación mediado por LiAc/PEG/ssDNA, optimizando su eficiencia mediante un choque térmico a 47?°C por 15 minutos. Esta condición incrementó la eficiencia de transformación, posiblemente debido a un aumento en la porosidad de la pared celular inducida por el calor. No obstante, se observaron limitaciones en la integración dirigida de ADN debido a la actividad predominante del mecanismo de unión de extremos no homólogos (NHEJ). En conjunto, los resultados respaldan la hipótesis de que temperaturas elevadas inducen modificaciones estructurales en la pared celular que favorecen la transformación genética. Este estudio proporciona información valiosa para el diseño de estrategias de ingeniería genética en K. marxianus, una levadura con alto potencial para aplicaciones industriales en biotecnología, como la producción de bioetanol, proteínas recombinantes y compuestos de alto valor.